PCR實驗常見問答

PCR實驗常見問答 | 時間: December-4 18:34:53 | 分類:技術欄目

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   常見問答

　　Q-1:

　　LA PCR的反應條件?

　　A-1:

　　因擴增片段的大小、反應體積、使用擴增儀器的不同而不同。

　　◇ 循環(huán)次數(shù)

　　根據(jù)模板DNA的量以及擴增片段的大小，設定25 ~ 30個循環(huán)。

　　如果循環(huán)次數(shù)太少，擴增量不足;如果循環(huán)次數(shù)太多，則會出現(xiàn)Smear。

　　◇ Anneal以及Extension

　　合適的Anneal溫度通常在45 ~ 68℃之間 (預備實驗可2℃間隔進行)。另外，由于TaKaRa LA Taq 在60 ~ 68℃間也有很高的活性, 因此可在此溫度范圍內設定Anneal-Extension溫度, 進行2 Step PCR。Anneal-Extension溫度為68℃ 時，每kbp大體可設定30秒 ~ 1分鐘;當溫度設定在68℃以下時, 時間設定可稍長一些。通常，Anneal溫度太高，有時會得不到擴增產(chǎn)物;Anneal溫度太低時，容易發(fā)生非特異性反應。另外，Extension時間太短時，會得不到擴增產(chǎn)物或者會有一些短的非特異性產(chǎn)物優(yōu)先生成;而Extension時間太長時，會出現(xiàn)Smear。

　　Q-2:

　　選擇LA PCR引物 (Primer) 時的注意事項?

　　A-2:

　　特異性非常重要。20mer左右的Primer, 如果特異性高，擴增20 kbp沒有問題，但如果可能的話，建議設計30 ~ 35mer左右。使用特異性低的Primer時，會出現(xiàn)很多非特異性產(chǎn)物。

　　Q-3:

　　LA PCR時酶的使用量?

　　A-3:

　　50 μl的反應體系可使用2.5 U的TaKaRa LA Taq。但合適的用量也與模板DNA的量及Complexity、擴增片段大小有關。酶量過多時，易發(fā)生非特異性反應，出現(xiàn)Smear;而酶量過少時，反應性能下降。

　　Q-4:

　　LA PCR時模板DNA的調制方法?

　　A-4:

　　模板DNA的質量是LA PCR成功與否的重要因素。擴增超過10 kbp的DNA片段時，用簡單的方法 (例如Cell只經(jīng)過加熱處理或Protease處理) 調制的DNA作模板不太合適， 建議使用充分精制的完整的DNA (沒有Nick等)。

　　Q-5:

　　是否可以對λ 噬菌體直接進行LA PCR反應?

　　A-5:

　　可以。99℃、10 min處理后的噬菌體約106 ~ 107 pfu作為模板，至少可擴增8 kbp的DNA片段。

　　Q-6:

　　對Mammalian cell或E. coli 只進行熱處理 (98℃， 2 min) 或Protease處理的樣品可否進行LA PCR?

　　A-6:

　　◇ 對E. coli只進行熱處理可擴增10 kbp的DNA片段 (50 ml PCR反應液中37℃ Overnight culture in L-both 使用2 μl)。

　　◇ Human細胞 (培養(yǎng)細胞) 如只經(jīng)過熱處理，可擴增數(shù)百bp;經(jīng)過Protease處理、 熱處理后的樣品，較多可擴增1 ~ 2 kbp。所以，如果要擴增長鏈DNA，建議使用經(jīng)過充分精制的完整的DNA作模板。

　　Q-7:

　　使用LA Taq是否也產(chǎn)生A的Overhang? (PCR產(chǎn)物是否可直接克隆于T-vector中?)

　　A-7:

　　可以。使用TaKaRa LA Taq 及TaKaRa Ex Taq 時的PCR產(chǎn)物產(chǎn)生A的Overhang，與使用TaKaRa Taq 時的PCR產(chǎn)物克隆于T-vector 的效率基本相同。

 

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