原位雜交組織化學(xué)技術(shù)的由來及發(fā)展
原位雜交組織化學(xué)技術(shù)的由來及發(fā)展 | 時間: December-7 11:15:59 | 分類:技術(shù)欄目
凌儀生物提供高速離心機，美國Bio-rad伯樂電泳，德國eppendorf艾本德移液器，美國ABI基因擴增儀PCR，雅培原位雜交儀，Thermo熱電離心機等實驗室儀器設(shè)備，以及Corning康寧，Axygen愛思進，Greiner格瑞拉等耗材要省錢，別錯過哦。 原位雜交組織（或細胞）化學(xué)技術(shù)簡稱原位雜交（In situ hybridization），如上所述，屬于固相核酸分子雜交的范疇。但它區(qū)別于固相核酸分子雜交中的任何一種核酸分子雜交技術(shù)。菌落雜交系細菌裂解釋放出DNA，然后進行雜交。Southern印跡雜交法是以鑒定DNA中某一特定的基因片段，而Norhtern印跡雜交法是用以檢測某一特定的RNA片段的。它們都只能證明該病原體、細胞或組織中是否存在待測的核酸而不能證明該核酸分子在細胞或組織中存在的部位。1969年美國耶魯大學(xué)Gall 和Pardue首先用爪蟾核糖體基因探針與其卵母細胞雜交，確定該基因定位于卵母細胞的核仁中。與此同時，Buongiorno – Nardelli和Amaldi,John及其同事等相繼利用同位素標(biāo)記核酸探針進行了細胞或組織的基因定位，從而創(chuàng)造了原位雜交細胞或組織化學(xué)技術(shù)。Orth（1970）應(yīng)用3H標(biāo)記的兔乳頭狀瘤病毒cRNA探針與兔乳頭狀瘤組織的冰凍切片進行雜交，首次用原位雜交檢測了病毒DNA在細胞中的定位，但當(dāng)時的工作多采用冰凍組織切片或培養(yǎng)細胞，探針均采用同位素標(biāo)記。
由于同位素標(biāo)記探針具有放射性既污染環(huán)境，又對人體有害，且受半衰期限制等缺點，科學(xué)工作者們開始探索用非放射性的標(biāo)記物標(biāo)記核酸探針進行原位雜交。Bauman（1981）等首先應(yīng)用熒光素標(biāo)記cRNA探針做原位雜交，然后用熒光顯微鏡觀察獲得成功。Shroyer（1982）報道用2，4二硝基苯甲醛（DNP）標(biāo)記DNA探針，使該DNA探針具有抗原性，然后用兔抗DNP的抗體來識別雜交后的探針，較后經(jīng)免疫過氧化物酶的方法來定位雜交探針。這兩種方法至今仍有采用，但因敏感度不夠高，應(yīng)用不夠普遍。
Pezzella（1987）創(chuàng)建了用磺基化DNA探針來做細胞或組織原位雜交的方法，其基本原理是使DNA探針的胞嘧啶堿基磺基化，利用單克隆抗體識別磺基化探針，再通過免疫組化方法顯示結(jié)合的單克隆抗體，從而對雜交結(jié)合的探針進行定位。本法的優(yōu)點是磺基化DAN探針標(biāo)記簡便，不需作缺口平移標(biāo)記，敏感度也較高。但自生物素和高辛標(biāo)記探針技術(shù)建立后，已有取而代之的趨勢。生物素標(biāo)記探針技術(shù)是Brigat（1983）首先建立的，它利用生物素標(biāo)記的探針在組織切片上檢測了病毒DNA，通過生物素與抗生物素結(jié)合，過氧化物酶-抗過氧化物酶顯示系統(tǒng)顯示病毒DNA在細胞中的定位。生物素標(biāo)記探針技術(shù)目前已被廣泛應(yīng)用，特別是在病毒學(xué)和病理學(xué)的臨床診斷中。這種生物素標(biāo)記技術(shù)又叫酶促生物素標(biāo)記技術(shù)。另一種叫光促生物素標(biāo)記核酸技術(shù)，該技術(shù)是用光敏生物素（Photobiotin）標(biāo)記核酸。目前應(yīng)用的光敏生物素有乙酸鹽和補骨脂素生物素，它們都是由三個部分組成：光敏基團、連結(jié)臂和生物素（圖20-1）。在強光下，不需酶反應(yīng)，光敏生物素的光敏基團即可與核酸中的堿基相結(jié)合。光敏生物素標(biāo)記核酸，方法簡單，靈敏度也不低，但標(biāo)記效率不高，每100～150個堿基才能標(biāo)記一個生物素，對于短的基因探針特別是寡核苷酸探針不宜使用，以免因標(biāo)記數(shù)過少而影響靈敏度（Forster et al 1985）。
