蛋白電泳現(xiàn)像之涂抹痕跡
蛋白電泳現(xiàn)像之涂抹痕跡 | 時間: January-4 18:05:40 | 分類:技術(shù)欄目
凌儀生物提供高速離心機，美國Bio-rad伯樂電泳，德國eppendorf艾本德移液器，美國ABI基因擴增儀PCR，雅培原位雜交儀，Thermo熱電離心機等實驗室儀器設(shè)備，以及Corning康寧，Axygen愛思進，Greiner格瑞拉等耗材要省錢，別錯過哦。如果你能夠非常熟練的制備一塊較好的凝膠，甚至對它進行改進都不十分困難，那么你真的應(yīng)該值得慶幸。但是如果你不能達到這個水平也不要灰心。
所有的優(yōu)秀的科學家都是從失敗中成長起來的，事實上，如果不出錯我們就很難學到更多的東西。
我們整理了 SDS-PAGE「失誤大全」，包括了過去實驗室中許多學生跑的較「爛」的膠，它們代表了人們在跑膠是較容易犯的多種錯誤（當然這些錯誤仍在更新之中）。
看你自己的膠缺陷也許并不能很好的解決問題，至少不是較好的解決方式，本文用圖例指出你可能在哪一些方面改進你的技術(shù)。
涂抹痕跡可能由于多種原因引起，但是較常見的原因是聚丙烯酰胺凝膠倒膠的不均勻或者上樣量過大。
這塊膠倒膠不正確，在上部膠倒入制膠槽之前就已經(jīng)發(fā)生聚合。首先倒入的膠聚合發(fā)生的太快了。與其重新倒膠，不如停止倒膠重新準備新的聚丙烯酰胺混合液，然后將新的膠倒入舊膠的上方。但是顯然這種連接不是非常牢固。我推薦重新倒膠，制膠很關(guān)鍵，如果你后續(xù)還要做 blot，膠沒有跑好浪費太多。
這塊膠每孔上樣量過大。大多數(shù)的泳道還是能分清條帶，但是在 3、4 道涂抹痕跡非常明顯。這些泳道的樣品主要含有一種蛋白（血紅蛋白的亞基），與 9、10 道一樣。但是，3、4 道的樣品低估了紅細胞裂解物和紅細胞胞漿組分中的蛋白含量。這些組分包含了過多的蛋白以至于樣品需要稀釋后才能進行蛋白含量測定。但是這名學生卻忘記了這個樣品已經(jīng)稀釋過了，因此造成了蛋白濃度的低估。（嚴重的失誤）
小型膠每孔的蛋白樣品的量為 20-40 微克，取決于所需的分辨率和混合液中包含的多肽數(shù)目。但是，如果是一個純化樣品上樣，一個帶包含了 20-40 微克蛋白，那么其結(jié)果肯定也是一團糟。
這也是一個上樣量過大的例子，這名學生似乎犯了和例 2 中同樣的錯誤，因此在膠上也表現(xiàn)出各泳道的不一致性。
涂抹痕跡可能常見于用非連續(xù)膠跑膜相關(guān)蛋白這類脂質(zhì)含量豐富的樣品。在非連續(xù) PAGE 中，樣品蛋白基于兩個因素而被超濃縮。
首先，當樣品從非限制性的積層膠移動至限制速度的分離膠時遷移速率陡然下降。其次，也是較重要的，pH 變化造成蛋白樣品電泳速率的改變，導致樣品突然停滯。一個高約半厘米左右的樣品被壓縮成為一個僅為數(shù)微米厚的薄層條帶，局部蛋白濃度急劇增加。
胞膜相關(guān)蛋白一般于較低濃度是沉淀，因此泳道的頂部通常有一條深色的條帶含有沉淀的蛋白。當電泳進行時沉淀的蛋白重新溶解然后持續(xù)進入凝膠，因此造成了一個持續(xù)性的較深的不可分辨的背景。許多膜相關(guān)蛋白的凝膠圖像都顯示同樣的特征。
上圖中 4、7 道的蛋白樣品雖然含有相同的蛋白量，但是第 4 道的樣品中含有的膜蛋白的量超過了凝膠的分辨能力，造成了很深的涂抹痕跡。
