熒光原位雜交（FISH）和用引物介導(dǎo)的原位標(biāo)記（PRINS）操作規(guī)程
熒光原位雜交（FISH）和用引物介導(dǎo)的原位標(biāo)記（PRINS）操作規(guī)程 | 時(shí)間: January-5 20:31:57 | 分類(lèi):技術(shù)欄目
凌儀生物提供高速離心機(jī)，美國(guó)Bio-rad伯樂(lè)電泳，德國(guó)eppendorf艾本德移液器，美國(guó)ABI基因擴(kuò)增儀PCR，雅培原位雜交儀，Thermo熱電離心機(jī)等實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備，以及Corning康寧，Axygen愛(ài)思進(jìn)，Greiner格瑞拉等耗材要省錢(qián)，別錯(cuò)過(guò)哦。設(shè)備
1、 醫(yī)用微波爐；
2、 水浴鍋；
3、 OLYMPUS BX51熒光顯微鏡；
4、 OLYMPUS DP11數(shù)字顯微照相機(jī)。
FISH試劑
（1）1×PBS：由10×PBS溶液稀釋而成，儲(chǔ)存于4℃；
（2）20×SSC（pH7.0）；
（3）2×SSC，由20×SSC溶液稀釋而成；
（4）25mg/ml蛋白酶K消化液。
（5）變性液(70％甲酰胺+2×SSC，pH7.0)：4ml 20×SSC；8ml蒸餾水；28ml甲酰胺。每次新鮮配制。
（6）雜交后洗滌液： 20×SSC 4ml；蒸餾水16ml；甲酰胺20ml。每次新鮮配制。調(diào)節(jié)pH前升至室溫。
實(shí)驗(yàn)步驟
1、脫蠟：
1）二甲苯脫蠟3次，每次5min；
2）100％酒精兩次，每次2min；
3）移出酒精，斜置切片，標(biāo)記末段向下，空氣干燥。
2、蛋白酶處理:
1）每個(gè)染色缸40ml蛋白酶K消化溶液，配制方法如下：2×SSC 40ml倒人Facal管，在水浴槽中預(yù)熱。將消化酶液加入管內(nèi)，搖動(dòng)直到酶溶解。
2） 37℃水浴槽中預(yù)熱染色缸和蛋白酶K溶液。37℃孵育20min。
3） ×SSC在室溫下漂洗切片3次，每次1min。
4）梯度酒精脫水（-20℃預(yù)冷）。
3、變性：
1）每一個(gè)立式染色缸配制40ml變性溶液；
2）78℃水浴槽中平衡預(yù)熱混合液染色缸；
3）78℃孵育8min；
4） 即移入-20℃預(yù)冷70%酒精的染色缸內(nèi)2min，再依次移入80%、90%和100%的-20℃預(yù)冷酒精內(nèi)，每缸2min；
5）空氣干燥。
4、雜交：
1）準(zhǔn)備探針；
2）取一個(gè)較大的濕盒，交叉放置切片；
3）滴10μl探針在切片的組織上，加蓋玻片；
4）蓋上濕盒蓋，37℃孵育12h～16h。
雜交后的水洗：
5）鑷子小心去除蓋玻片；
6）43℃預(yù)熱雜交后水洗溶液40ml水洗切片15min；
7）2×SSC(37℃)洗兩次，每次10min；
8）切片放人染色缸的1×PBS內(nèi)待檢測(cè)，勿使切片干燥。
檢測(cè)：
9）從1×PBS中取出切片，除去過(guò)多的水分，避免標(biāo)本干燥。把切片放入濕盒內(nèi)，同時(shí)處理4張切片。
10）每張切片使用30μl～60μl羅丹明抗-地高辛抗體或FITC卵白素，室溫下孵育20min；
11）去掉塑料蓋膜，把切片放入含1×PBS的染色缸。1×PBS室溫下洗3次，每次2min。
擴(kuò)增：
12）從1×PBS中取出切片，斜置切片使液體排出；
13）每張切片滴30μl～60μl抗-卵白素抗體，加塑料蓋膜，室溫孵育20min；
14）去掉塑料蓋膜，把切片放人含1×PBS的染色缸。1×PBS室溫下洗3次，每次2min；
15）從1×PBS中取出切片，斜置切片使液體排出；
16）每張切片滴30μl～60μl抗-卵白素抗體，加塑料蓋膜，室溫孵育20min；
17）1×PBS室溫下洗3次，每次2min。
5、細(xì)胞核染色：
1）張切片加10μl～20μl DAPI，覆蓋蓋玻片并在室溫下孵育2～5ml；
2）盡可能快的在熒光顯微鏡下觀察或封閉盒內(nèi)保存在-20℃冰箱。切片在染色之后1h內(nèi)可以在顯微鏡下觀察。
PRINS步驟
1、常規(guī)脫蠟浸入0.01mol/LPBS；
2、用0.2mol/L鹽酸處理5min；
3、蛋白酶K(25μg/m1)消化37℃ 15min；
4、分別用80％，95％和100％酒精脫水，室溫干片；
5、加PCR混合液25μL(10mmol/L Tris-HCl，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2，各加200μmol/L dATP，dCTP，dGTP，1.5mmol/L dig-11-dUTP l.5μl，引物250ng，Taq DNA聚合酶2U)，加蓋片；
6、94℃變性5min后置入65℃濕盒中5min；
7、用0.1×SSC液，65℃洗5min；
8、片于65℃ 10s～20s；用4×SSC-0.1％吐溫20液42℃洗5min，2次；
9、經(jīng)Buffer I液洗后滴加20％羊血清封閉30min；
10、加地高辛抗體復(fù)合物(1:500)室溫下2h；
11、BufferⅢ液洗5min；
12、用BCIP-NBT顯色1h～2h，在鏡下控制，終止顯色；
13、用中性紅或核固紅襯染，酒精脫水，二甲苯透明，樹(shù)脂封片。
