蛋白質(zhì)提取與制備
蛋白質(zhì)提取與制備 | 時(shí)間: October-18 12:29:09 | 分類:技術(shù)欄目
凌儀生物提供高速離心機(jī)，美國Bio-rad伯樂電泳，德國eppendorf艾本德移液器，美國ABI基因擴(kuò)增儀PCR，雅培原位雜交儀，Thermo熱電離心機(jī)等實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備，以及Corning康寧，Axygen愛思進(jìn)，Greiner格瑞拉等耗材要省錢，別錯(cuò)過哦。1、蛋白質(zhì)提取與制備
蛋白質(zhì)提取與制備蛋白質(zhì)種類很多，性質(zhì)上的差異很大，既或是同類蛋白質(zhì)，因選用材料不同，使用方法差別也很大，且又處于不同的體系中，因此不可能有一個(gè)固定的程序適用各類蛋白質(zhì)的分離。但多數(shù)分離工作中的關(guān)鍵部分基本手段還是共同的，大部分蛋白質(zhì)均可溶于水、稀鹽、稀酸或稀堿溶液中，少數(shù)與脂類結(jié)合的蛋白質(zhì)溶于乙醇、丙酮及丁醇等有機(jī)溶劑中。因此可采用不同溶劑提取、分離及純化蛋白質(zhì)和酶。蛋白質(zhì)與酶在不同溶劑中溶解度的差異，主要取決于蛋白分子中非極性疏水基團(tuán)與極性親水基團(tuán)的比例，其次取決于這些基團(tuán)的排列和偶極矩。故分子結(jié)構(gòu)性質(zhì)是不同蛋白質(zhì)溶解差異的內(nèi)因。溫度、pH、離子強(qiáng)度等是影響蛋白質(zhì)溶解度的外界條件。提取蛋白質(zhì)時(shí)常根據(jù)這些內(nèi)外因素綜合加以利用。將細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)提取出來。并與其它不需要的物質(zhì)分開。但動物材料中的蛋白質(zhì)有些可溶性的形式存在于體液（如血漿、消化硫等）中，可以不必經(jīng)過提取直接進(jìn)行分離。蛋白質(zhì)中的角蛋白、膠原及絲蛋白等不溶性蛋白質(zhì)，只需要適當(dāng)?shù)娜軇┫慈タ扇苄缘陌殡S物，如脂類、糖類以及其他可溶性蛋白質(zhì)，較后剩下的就是不溶性蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)經(jīng)細(xì)胞破碎后，用水、稀鹽酸及緩沖液等適當(dāng)溶劑，將蛋白質(zhì)溶解出來，再用離心法除去不溶物，即得粗提取液。水適用于白蛋白類蛋白質(zhì)的抽提。如果抽提物的pH 用適當(dāng)緩沖液控制時(shí)，共穩(wěn)定性及溶解度均能增加。如球蛋白類能溶于稀鹽溶液中，脂蛋白可用稀的去垢劑溶液如十二烷基硫酸鈉、洋地黃皂苷（Digitonin)溶液或有機(jī)溶劑來抽提。其它不溶于水的蛋白質(zhì)通常用稀堿溶液抽提。
1.1蛋白質(zhì)提取與制備概述
蛋白質(zhì)的制備是一項(xiàng)十分細(xì)致的工作。涉及物理學(xué)、化學(xué)和生物學(xué)的知識很廣。近年來雖有了不少改進(jìn)，但其主要原理仍不外乎兩個(gè)方面：一是利用混合物中幾個(gè)組分分配率的差別，把它們分配于可用機(jī)械方法分離的兩個(gè)或幾個(gè)物相中，如鹽析、有機(jī)溶劑提取、層析和結(jié)晶等；二是將混合物置于單一物相中，通過物理力場的作用使各組分分配于不同區(qū)域而達(dá)到分離的目的，如電泳、超離心、超濾等。由于蛋白質(zhì)不能溶化，也不能蒸發(fā)，所能分配的物相只限于固相和液相，并在這兩相間互相交替進(jìn)行分離純化。制備方法可按照分子大小、形狀、帶電性質(zhì)及溶解度等主要因素進(jìn)行分類。按分子大小和形態(tài)分為差速離心、超濾、分子篩及透析等方法；按溶解度分為鹽析、溶劑抽提、分配層析、逆流分配及結(jié)晶等方法；按電荷差異分為電泳、電滲析、等電點(diǎn)沉淀、離子交換層析及吸附層析等；按生物功能專一性有親合層析法等。
由于不同生物大分子結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)不同，分離方法也不一樣。即同一類生物大分子由于選用材料不同，使用方法差別也很大。因此很難有一個(gè)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的方法對任何蛋白質(zhì)均可循用。因此實(shí)驗(yàn)前應(yīng)進(jìn)行充分調(diào)查研究，查閱有關(guān)文獻(xiàn)資料，對欲分離提純物質(zhì)的物理、化學(xué)及生物學(xué)性質(zhì)先有一定了解，然后再著手進(jìn)行實(shí)驗(yàn)工作。對于一個(gè)未知結(jié)構(gòu)及性質(zhì)的試樣進(jìn)行創(chuàng)造性的分離提純時(shí)，更需要經(jīng)過各種方法比較和摸索，才能找到一些工作規(guī)律和獲得預(yù)期結(jié)果。其次在分離提純工作前，常須建立相應(yīng)的分析鑒定方法，以正確指導(dǎo)整個(gè)分離純化工作的順利進(jìn)行。高度提純某一生物大分子，一般要經(jīng)過多種方法、步驟及不斷變換各種外界條件才能達(dá)到目的。因此，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程方法的優(yōu)劣，選擇條件效果的好壞，均須通過分析鑒定來判明。
另一方面，蛋白質(zhì)常以與其他生物體物質(zhì)結(jié)合形式存在，因此也易與這些物質(zhì)結(jié)合，這給分離精制帶來了困難。如極微量的金屬和糖對巨大蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性起決定作用，若被除去則不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)結(jié)晶化的難度也隨之增加。如高峰淀粉酶A 的Ca2+，胰島素Zn2+等。此外，高分子蛋白質(zhì)具有一定的立體構(gòu)象，相當(dāng)不穩(wěn)定，如前所述極易變性、變構(gòu)，因此限制了分離精制的方法。通常是根據(jù)具體對象聯(lián)用各種方法。為得到天然狀態(tài)的蛋白質(zhì)，盡量采用溫和的手段，如中性、低溫、避免起泡等，并還要注意防腐。注意共存成分的影響。如蝮蛇粗毒的蛋白質(zhì)水解酶活性很高，在分離純化中需引起重視。純化蝮蛇神經(jīng)毒素時(shí)，當(dāng)室溫超過
1.2蛋白質(zhì)提取與制備具體操作方法
早年為了研究的方便，盡量尋找含某種蛋白質(zhì)豐富的器官從中提取蛋白質(zhì)。但至目前經(jīng)常遇到的多是含量低的器官或組織且量也很小，如下丘腦、松果體、細(xì)胞膜或內(nèi)膜等原材料，因而對提取要求更復(fù)雜一些。原料的選擇主要依據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩?。從工業(yè)生產(chǎn)角度考慮，注意選含量高、來源豐富及成本低的原料。盡量要新鮮原料。但有時(shí)這幾方面不同時(shí)具備。含量豐富但來源困難，或含量來源均理想，但分離純化操作繁瑣，反而不如含量略低些易于獲得純品者。一般要注意種屬的關(guān)系，如鰹的心肌細(xì)胞色素C 較馬的易結(jié)晶，馬的血紅蛋白較牛的易結(jié)晶。要事前調(diào)查制備的難易情況。若利用蛋白質(zhì)的活性，對原料的種屬應(yīng)幾乎無影響。如利用胰蛋白酶水解蛋白質(zhì)的活性，用豬或牛胰臟均可。但若研究蛋白質(zhì)自身的性質(zhì)及結(jié)構(gòu)時(shí)，原料的來源種屬必須一定。研究由于病態(tài)引起的特殊蛋白質(zhì)（本斯.瓊斯氏蛋白、貧血血紅蛋白）時(shí)，不但使用種屬一定的原料，而且要取自同一個(gè)體的原料?？赡軙r(shí)盡量用全年均可采到的原料。對動物生理狀態(tài)間的差異（如饑餓時(shí)脂肪和糖類相對減少），采收期及產(chǎn)地等因素也要注意。
1.2.2前處理
1.2.2.1細(xì)胞的破碎
材料選定通常要進(jìn)行處理。要剔除結(jié)締組織及脂肪組織。如不能立即進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，則應(yīng)冷凍保存。除了提取及胞細(xì)外成分，對細(xì)胞內(nèi)及多細(xì)胞生物組織中的蛋白質(zhì)的分離提取均須先將細(xì)胞破碎，使其充分釋放到溶液中。不同生物體或同一生物體不同的組織，其細(xì)胞破壞難易不一，使用方法也不完全相同。如動物胰、肝、腦組織一般較柔軟，作普通勻漿器磨研即可，肌肉及心組織較韌，需預(yù)先絞碎再制成勻槳。
⑴機(jī)械方法
主要通過機(jī)械切力的作用使組織細(xì)胞破壞。常用器械有：①高速組織搗碎機(jī)（轉(zhuǎn)速可達(dá)10000rpm，具高速轉(zhuǎn)動的鋒利的刀片），宜用于動物內(nèi)臟組織的破碎；②玻璃勻漿器（用兩個(gè)磨砂面相互摩擦，將細(xì)胞磨碎），適用于少量材料，也可用不銹鋼或硬質(zhì)塑料等，兩面間隔只有十分之幾毫米，對細(xì)胞破碎程度較高速搗碎機(jī)高，機(jī)械切力對分子破壞較小。小量的也可用乳缽與適當(dāng)?shù)木彌_劑磨碎提取，也可加氧化鋁、石英砂及玻璃粉磨細(xì)。但在磨細(xì)時(shí)局部往往生熱導(dǎo)致變性或pH 顯著變化，尤其用玻璃粉和氧化鋁時(shí)。磨細(xì)劑的吸附也可導(dǎo)致?lián)p失。
⑵物理方法
主要通過各種物理因素的作用，使組織細(xì)胞破碎的方法。
a 反復(fù)凍融法
于冷藏庫或干冰反復(fù)于零下15～20℃使之凍固，然后緩慢地融解，如此反復(fù)操作，使大部分細(xì)胞及細(xì)胞內(nèi)顆粒破壞。由于滲透壓的變化，使結(jié)合水凍結(jié)產(chǎn)生組織的變性，冰片將細(xì)胞膜破碎，使蛋白質(zhì)可溶化，成為粘稠的濃溶液，但脂蛋白凍結(jié)變性。
b 冷熱變替法
將材料投入沸水中，于
c 超聲波法
暴露于9～10 千周聲波或10～500 千周超聲波所產(chǎn)生的機(jī)械振動，只要有設(shè)備該法方便且效果也好，但一次處理量較小。應(yīng)用超聲波處理時(shí)應(yīng)注意避免溶液中氣泡的存在。處理一些超聲波敏感的蛋白質(zhì)酶時(shí)宜慎重。
d 加壓破碎法
加一定氣壓或水壓也可使細(xì)胞破碎。
⑶化學(xué)及生物化學(xué)方法
a 有機(jī)溶媒法
粉碎后的新鮮材料在
b 自溶法
將待破碎的鮮材料在一定pH 和適當(dāng)?shù)臏囟认拢米陨淼牡鞍酌笇⒓?xì)胞破壞，使細(xì)胞內(nèi)含物釋放出來。比較穩(wěn)定，變性較難，蛋白質(zhì)不被分解而可溶化。利用該法可從胰臟制取羧肽酶。自體融解時(shí)需要時(shí)間，需加少量甲苯、氯仿等。應(yīng)防止細(xì)菌污染。于溫室
c 酶法
與前述的自體融法同理，用胰蛋白酶等蛋白酶除去變性蛋白質(zhì)。但值得提出的是溶菌酶處理時(shí)，它能水解構(gòu)成枯草菌等菌體膜的多糖類。能溶解菌的酶分布很廣。尤其卵白中含量高，而多易結(jié)晶化。
1.2.2.2細(xì)胞器的分離
制備某一種生物大分子需要采用細(xì)胞中某一部分的材料，或者為了純化某一特定細(xì)胞器上的生物大分子，防止其他細(xì)胞組分的干擾，細(xì)胞破碎后常將細(xì)胞內(nèi)各組分先行分離，對于制備一些難度較大需求純度較高的生物大分子是有利的。尤其近年來分子生物學(xué)、分子遺傳學(xué)、遺傳工程等學(xué)科和技術(shù)的發(fā)展，對分布在各種細(xì)胞器上的核酸和蛋白質(zhì)的研究工作日益增多，分離各種細(xì)胞器上的各類核酸和特異性蛋白質(zhì)已成為生物大分子制備工作重要內(nèi)容之一。各類生物大分子在細(xì)胞內(nèi)的分布是不同的。DNA 幾乎全部集中在細(xì)胞核內(nèi)。RNA 則大部分分布于細(xì)胞質(zhì)。各種酶在細(xì)胞內(nèi)分布也有一定位置。因此制備細(xì)胞器上的生物大分子時(shí)，預(yù)先須對整個(gè)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和各類生物大分子在細(xì)胞內(nèi)分布匹有所了解。
細(xì)胞器的分離一般采用差速離心法。細(xì)胞經(jīng)過破碎后，在適當(dāng)介質(zhì)中進(jìn)行差速離心。利用細(xì)胞各組分質(zhì)量大小不同，沉降于離心管內(nèi)不同區(qū)域，分離后即得所需組分。細(xì)胞器的分離制備、介質(zhì)的選擇十分重要。較早使用的介質(zhì)是生理鹽水。因它容易使亞細(xì)胞顆粒發(fā)生聚集作用結(jié)成塊狀，沉淀分離效果不理想，現(xiàn)一般改用蔗糖、Ficoll（一種蔗糖多聚物）或葡萄糖-聚乙二醇等高分子溶液。水溶液提取：大部分蛋白質(zhì)均溶于水、稀鹽、稀堿或稀酸溶液中。因此蛋白質(zhì)的提取一般以水為主。稀鹽溶液和緩沖溶液對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性好、溶度大，也是提取蛋白質(zhì)的較常用溶劑。鹽溶液提?。阂喳}溶液及緩沖液提取蛋白質(zhì)進(jìn)常注意下面幾個(gè)因素。
a 鹽濃度
等滲鹽溶液尤以0.02～0.05mol/L 磷酸鹽緩沖液和碳酸鹽緩沖液常用。0.15mol/L 氯化鈉溶液應(yīng)用也較多。如6-磷酸葡萄糖脫氫酶用0.1mol/L 碳酸氫鈉液提取等。有時(shí)為了螯合某些金屬離子和解離酶分子與其他雜質(zhì)的靜電結(jié)合，也常使用枸櫞酸鈉緩沖液和焦磷酸鈉緩沖液。有些蛋白質(zhì)在低鹽濃度下濃度低，如脫氧核糖核蛋白質(zhì)需用1mol/L 以上氯化鈉液提取?？傊?，只要能溶解在水溶液中而與細(xì)胞顆粒結(jié)合不太緊密的蛋白質(zhì)和酶，細(xì)胞破碎后選擇適當(dāng)?shù)柠}濃度及PH，一般是不難提取的。只有某些與細(xì)胞顆粒上的脂類物質(zhì)結(jié)合較緊的，需采用有機(jī)溶劑或加入表面活性劑處理等方法提取。
b PH 值：
蛋白質(zhì)提取液的PH 值首先應(yīng)保證在蛋白質(zhì)穩(wěn)定的范圍內(nèi)，即選擇在偏離等電點(diǎn)兩側(cè)。如堿性蛋白質(zhì)則選在偏酸一側(cè)，酸性蛋白質(zhì)選擇偏堿一側(cè)，以增大蛋白質(zhì)的溶解度，提高提取效果。如細(xì)胞色素C 屬堿性蛋白質(zhì)，常用稀酸提取，肌肉甘油醛-3-磷酸脫氫酶屬酸性蛋白質(zhì)，用稀堿提取。某些蛋白質(zhì)或酶與其分物質(zhì)結(jié)合常以離子鍵形式存在，選擇PH3～6 范圍對于分離提取是有利的。
c 溫度：
多數(shù)酶的提取溫度在
d 有機(jī)溶劑提取：
有機(jī)溶劑提取用于提取蛋白質(zhì)的實(shí)例至今是不多的。但一些和脂結(jié)合較牢或分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)，不溶于水、稀鹽或稀堿液中，可用不同比例的有機(jī)溶劑提取。從一些粒線體（Mitochondria)及微粒體（Microsome)等含多量脂質(zhì)物質(zhì)中提取蛋白質(zhì)時(shí)，采用Morton 的丁醇法效果較好。因丁醇使蛋白質(zhì)的變性較少，親脂性強(qiáng)，易透入細(xì)胞內(nèi)部，與水也能溶解10%，因此具有脂質(zhì)與水之間的表面活性作用，可占據(jù)蛋白質(zhì)與脂質(zhì)的結(jié)合點(diǎn)，也阻礙蛋白質(zhì)與脂質(zhì)的再結(jié)合，使蛋白質(zhì)在水中溶解能力大大增加。丁醇提取法的pH 及溫度選擇范圍較廣（pH3～10，溫度
e 表面活性劑的利用：
對于某些與脂質(zhì)結(jié)合的蛋白質(zhì)和酶，也有采用表面活性劑如膽酸鹽及十二烷基硫酸鈉等處理。表面活性劑有陰離子型（如脂肪酸鹽、烷基苯磺酸鹽及膽酸鹽等），陽離子型（如氧化芐烷基二甲基銨等）及非離子型（Triton X-100 、TirtonX-114、吐溫60 及吐溫80）等。非離子型表面活性劑比離子型溫和，不易引起酶失活，使用較多。對于膜結(jié)構(gòu)上的脂蛋白和結(jié)構(gòu)，己廣泛采用膽酸鹽處理，兩者形成復(fù)合物，并帶上凈電荷，由于電荷再排斥作用使膜破裂。近年來研究膜蛋白使用表面活性劑的稀溶液提取時(shí)，較喜歡用非離子型表面活性劑。
f 對提取物的保護(hù)：
在各種細(xì)胞中普遍存在著蛋白水解酶，提取時(shí)要注意防止由它引起的水解。前面所講的降低提取溫度其目的之一也是防止蛋白水解酶的水解。多數(shù)蛋白水解酶的較適PH 在3～5 或更高些，因在較低PH 條件下可降低蛋白質(zhì)水解酶引起的破壞程度。低pH可使許多酶的酶原在提取過程中不致激活而保留在酶原狀態(tài)，不表現(xiàn)水解活力。加蛋白質(zhì)水解酶的抑制劑也同樣起保護(hù)作用，如以絲氨酸為活性中心的酶加二異丙基氟磷酸，以巰基為中心的酶加對氯汞苯甲酸等。提取溶液中加有機(jī)溶劑時(shí)也能產(chǎn)生相類似的作用。蛋白水解酶的性質(zhì)變化很大，上述條件均視具體對象而變化。有一些蛋白含巰基，這些巰基可能是活性所必需。在提取這種蛋白不要帶入金屬離子和氧化劑。前者可往提取液中加金屬螯合劑如EDTA，后者可加入還原劑如抗壞血酸。有某些蛋白質(zhì)帶一些非共價(jià)鍵結(jié)合的配基。提取時(shí)要注意保護(hù)，不要使酸基丟失。
