原位雜交實驗技術(shù)主要器材和實驗步驟

原位雜交實驗技術(shù)主要器材和實驗步驟 | 時間: December-7 11:25:02 | 分類:技術(shù)欄目

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    關(guān)于原位雜交實驗技術(shù)主要器材

醫(yī)用微波爐，恒溫水浴箱、濕盒、PNP筆等。

三、試劑

試劑:

●  2.5ml/L 的醋酸--2.5ml/L醋酸酐:

三乙醇胺 13.2ml

氯化鈉 5g

濃鹽酸 4ml

醋酸酐（用前加） 2.5ml；

●  20×SSC（pH7.0）：

氯化鈉 175.3g

枸櫞酸鈉 88.2g

雙蒸水定容至1L；

●  100×Denhardt‘s:

Ficoll 1g

PVP 1g

BSA 1g

ddH2O 定容至50ml；

●  雜交液：（50ml） 用量 終濃度

100%去離子甲酰胺 25ml 50%

100%葡聚糖硫酸脂 5mg 10%

100×Denhard‘s 0.5ml 1

1Mtris-HCL（PH8.0） 0.5ml 10Mm

5M NaCl 3ml 0.3M

0.5M EDTA （PH8.0） 0.1ml 1mM

10mg/ml 變性魚精DNA 0.5ml 100ug/ml

ddH2O定容至25ml

●  0.1M甘氨酸/PBS:

甘氨酸 7.5g

Na2HPO4 30.8g

NaH2PO4 2.8g

NaCl 8.5g

溶于800mlddH2O，定容至1000ml，高壓，室溫儲存；

●TSM1 （1000ml）：

1MTris-HCL（PH8.0） 100ml

5M NaCl 20ml

1M MgCl2 10ml

ddH2O定容至1000ml；

●TSM2 （1000ml）：

1MTris-HCL（PH8.0） 100ml

5M NaCl 20ml

1M MgCl2 50ml

ddH2O定容至1000ml；

●  抗體稀釋液： 100ml

BSA 1.0g

Tris X-100 0.4ml

疊氮鈉 0.4g

0.05M PBS （PH7.2）調(diào)至100ml；

●  0.05M PBS （PH7.2）：1000ml

Na2HPO4 15.4g

NaH2PO4 1.4g

NaCl 4.25g

●去內(nèi)源性酶液（40ml）：

儲存液 用量 終濃度

10%甲醛 4.0ml 0.3—0.5%

冰醋酸 10.0ml 25.0%

加0.05MPBS至40ml

●  0.4% Triton-X 100

 

四、關(guān)于原位雜交實驗技術(shù)操作步驟：

一質(zhì)粒制備

1質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化和擴增

1.1制備XL1-Blue感受態(tài)細(xì)菌

1．  取400uL XL1-Blue菌種加入到含200ml LB培養(yǎng)基的錐形瓶中，37 ℃、100 rpm培養(yǎng)4h，離心，倒置，以冰冷的0.1 mol／L

CaCl_2重懸細(xì)菌，冰浴30 min， 離心，棄上清，倒置，再加4ml(含15％甘油)冰冷的CaCl2重懸細(xì)菌，分裝(200  μ／tube)，-80

℃保存。

2．  轉(zhuǎn)化：在冰浴中將1管XL1-Blue感受態(tài)菌解凍，將濃度為2ng／μ1的質(zhì)粒 DNA4μ1加入到8Oμ1感受態(tài)菌中。

3．  輕輕搖勻，冰浴30 min。

4．42 ℃熱激9O秒，然后迅速冰浴2 min。

5．  加入LB培養(yǎng)液(無氨芐青霉素)0.8ml，在37 ℃，100轉(zhuǎn)／min水浴孵育 60 min。

6．取200μl菌液鋪于瓊脂板上(涂有X-Gal(20mg／ml)-IPTG(200mg／ml)的 LB-氨芐青霉素50

mg／ml,1μl／ml培養(yǎng)基)，待菌液全部被吸收后，倒置平 板于37 ℃培養(yǎng)12-16h。

1.2鑒定和挑選含重組質(zhì)粒的菌落

1．  用無菌牙簽挑取單菌落，接種到10 ml含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液的離心管中，于37 ℃，200轉(zhuǎn)／分培養(yǎng)2h，取1

ml之一Eppendorf離心管，加50μl 10mmol／L EDTA(pH 8.0)。

2．  加入50μl新配置的0.2mol／L NaOH、0.5％SDS、20％蔗糖溶液后，振蕩3O秒。

3．  在70 ℃溫育5 min，然后冷卻到室溫。

4．  加1.5μ14mol／L KCl和0.5μ1含0.4％溴酚蘭染液，振蕩3O秒后，冰浴5min。

5．  12000g，4 ℃離以 3 min，以除去細(xì)菌碎片。

6．  制備1％的瓊脂糖凝膠(含EB0.5μg／ml)，取50μl上清液加入到樣品孔中，其中一孔加入中等分子量DNA Marker。恒壓50V，進(jìn)行電泳。

7．  當(dāng)溴酚蘭遷移到凝膠全長的2／3-3／4時，停止電泳，在紫外燈下檢查質(zhì)粒DNA分于量的大小是否與轉(zhuǎn)入質(zhì)粒相符。

1.3質(zhì)粒的擴增和純化

1．  用無菌牙簽分別挑取單個白色菌落移入含30ml LB-氨芐青霉素(50μg／ml)培養(yǎng)液的聚丙烯管中，于37 ℃，200轉(zhuǎn)／分培養(yǎng)3h。

2．  將菌液轉(zhuǎn)入含70 ml LB-氨芐青霉素培養(yǎng)液的250ml錐形瓶中，37 ℃，200轉(zhuǎn)／分培養(yǎng)過夜(12-16h)，細(xì)菌渾濁。

3.  菌液中加入氯霉素液(34mg溶于lml乙醇，100ml菌液加入0.5ml氯霉素溶液，終濃度為170 μ／ml)。37 ℃，200轉(zhuǎn)／分培養(yǎng)12-16h。

4.  將培養(yǎng)的細(xì)菌倒入50ml的離心管中，6000rpm，4 ℃離,th,15 min，沉淀細(xì)菌。

5.  棄凈上清夜，用2ml預(yù)冷的溶液I，懸浮菌體沉淀，劇烈振蕩，于室溫靜置5 min

6.  加入新配制的溶液II 4ml，快速用手晃動10秒，顛倒數(shù)次后，于室溫靜置10 min。

7.  加入預(yù)冷的溶液III 3ml，溫和振蕩l0秒，于冰上靜置10 min，出現(xiàn)白色絮狀沉淀。

8．  6000rpm，4 ℃離心15 min，保留上清。

9．  將上清(若帶細(xì)菌殘片，則再次離心)移入另一50ml的離心管中，加入O.6倍體積的異丙醇混勻，于室溫靜置10 min。(或-20 ℃4h，或4

℃過夜，可便核酸沉淀)

10.12000 rpm，4 ℃離心15 min，回收核酸。小心棄去上清，倒置離心管使殘 兼上清液流盡。

11．于室溫用70％的乙醇洗滌沉淀物和管壁，室溫12000 rpm離心，15 min，充分棄去乙醇，于室溫將離心管倒置在紙巾上，使較后殘余的痕量乙醇揮發(fā)殆盡。

12．用500μl TE(pH8.0)溶解核酸沉淀，轉(zhuǎn)移至1.5 ml Eppendorf管中。

13．加入用冰預(yù)冷的5mol／L的LiCl溶液600μl，充分混勻。12000 rpm，4 ℃離心15 min，以沉淀高分子量的RNA。

14.將上清轉(zhuǎn)移到另一1.5 ml Eppendorf管中，加等量異丙醇，充分混勻，于室溫靜置10min。

15.12000 rpm,4 ℃離心15 min，回收核酸。小心棄去上清，倒置離心管使殘余上清液流盡。

16．于室溫用70％的乙醇洗滌沉淀物和管壁，室溫12000 rpm離心，15 min，充分棄去乙醇，于室溫將離心管倒置在紙巾上，使較后殘余的痕量乙醇揮發(fā)殆盡。

17.400μl含無DNA酶的RNA酶(20μg/ml)的TE緩沖液(pH8.0)溶解沉淀，將溶液轉(zhuǎn)移到另－1.5 ml

Eppendorf管中，室溫放置1.5ml Eppendorf管中30min。

18．加入400μl  13％(v／v)的PEG 8000-NaCl(1.6 mol／L)，混勻，4 ℃ 12000 rpm離心5

min以回收質(zhì)粒DNA，棄去上清。

19．加入400μl TE緩沖液(pH 8.O)溶解沉淀，再分別用等體積的Tris飽和酚、酚：氯仿：異戊醇(25：24：1)、和氯仿各抽提一次。

20．將水相(上清)移入另一1.5ml Eppendorf管中，加入O.1體積(約50μ13M 的醋酸鈉(pH 5.2)和2倍體積(大約1

ml)的無水乙醇，充分混勻后于4 ℃放置30 min。

21．于4 ℃ 12000 rpm離心5 min回收沉淀的質(zhì)粒DNA。盡可能棄去上清，敞開管口，置工作臺上使殘留的痕量乙醇蒸發(fā)殆盡。

22．加入400 μl處于4 ℃的70％乙醇，稍加振蕩，漂洗沉淀，4 ℃ 12000 rpm離心2 min。

23．吸去上清，室溫敞開管口，直到乙醇完全揮發(fā)。

24．用100μl TE緩沖液(pH 8.0)溶解沉淀。

25．取4μl溶液1：100稀釋后，測定其OD260、OD280，以確定質(zhì)粒DNA的

純度和濃度(OD260／OD280>1.8。OD260／OD280對DNA而言其值大約為1.8，高于2.0則可能有RNA污染，低于1.8則有蛋白質(zhì)污染。；DNA濃度

=OD260 X 0.05 X稀釋倍數(shù)(μg／μl)。

26．質(zhì)粒DNA溶液于-20 ℃保存待用。

cRNA探針的標(biāo)記

1．  將質(zhì)粒DNA，用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶線性化，通過瓊脂糖凝膠電泳以確保完全線性化。

2．  線性化后的DNA按“質(zhì)粒的純化”步驟19-24進(jìn)行純化，作為cRNA探針 標(biāo)記的模板，用相應(yīng)的RNA聚合酶合成地高辛標(biāo)記的反義和正義RNA探 針。

3．  進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，步驟如下：

4．  在冰上將各試劑加入一1.5 ml無RNA酶的Eppendorf管中。

DEPC處理的三蒸水8μl

質(zhì)粒DNA模板  0.05μg／μl   1μl

10 x NTP地高辛標(biāo)記混合物  1 x  2μl

0.1 M DTT溶液   10 mM   2μl

5 x轉(zhuǎn)錄緩沖液 1 x   4μl

RNAse抑制劑  2U／μl  1μl

RNA聚合酶   2U/μl    2μl

反應(yīng)體系總體積   20μl

5．  加入上述各試劑后，混勻，簡短離心后在37 ℃孵育2h。

6．  加入2μl無RNA酶的DNA酶I(10U／μ1)，37 ℃孵育15 min降解模板DNA。

7．  加入0.2M EDTA(pH 8.0)溶液2μl終止反應(yīng)。

8．  加入2.5μl的4 M Licl和7.5μl冷的無水乙醇，混勻，-20 ℃放置2h。

9．  12000g下離以 15 min，棄上清，小心地用50 μl冷的70％乙醇洗滌沉淀。

1O．室溫下稍干燥，溶于100μ1 DEPC處理過的三蒸水中，混勻分裝，-20 ℃下保持備用。

冰凍切片與雜交前預(yù)處理：

1．  將樣品從-80 ℃取出，用OCT包埋，在-23 ℃(切片機腔體溫度)平衡至少30

min。將包埋好的樣品固定在樣品頭上，切10μm厚的連續(xù)組織切片，平鋪于涂有多聚賴氨酸(1mg／m1)的玻片上(玻片預(yù)先經(jīng)180 ℃干烤6小時)，保存于-70

℃冰柜備用。

2．  冰凍切片經(jīng)室溫干燥10 min后，在4％的多聚甲醛-PBS(pH 7.4)固定lOmin。

3．  活躍的DEPC-PBS(未高壓的0.1％DEPC-1XPBS溶液)洗2次，每次5 min。

4．  在0.2M的鹽酸作用中作用10 min后，重復(fù)步驟4)。

5．  在切片上滴加蛋白酶K(0.1μg／m1)，37 ℃孵育15 min，重復(fù)步驟4)。

6．  經(jīng)0.1M TEA(三乙醇胺)作用5min后，再在新配制的0.25％AA／0.1M TEA (乙酸酐／三乙醇胺，pH 8.0)中乙酰化10

min。(在大多數(shù)實驗中，步驟4，5，6省略)

7．  5 x SSC中平衡15 min。

雜交：

（一）                  脫蠟，水化：

1、  二甲苯10min 兩次

2、 無水乙醇3min 兩次

３、95%乙醇3min 一次

４、75%乙醇3min 一次

５、50%乙醇2min 一次

６、重蒸水2min 一次

７、PBS洗滌5min

（二）將組織芯片放入去內(nèi)源性酶液中浸泡30min；PBS洗滌5min

（三）0.1M甘氨酸去游離醛基 15min；0.4%tritonX-100 洗10min；

（四）用蛋白酶K與37℃孵育30min ，PBS振洗5min

（五） 在0.1mol/L三乙醇胺——0.25%乙酸酐中孵育10min ;在2×SSC中洗5min ；

（六） 滴加預(yù)雜交液42℃,30min；將RNA探針用預(yù)雜交液稀釋（1ng/ｕL~2ng/ｕL）

（七）雜交

１、在載玻片表面覆蓋上雜交小室，加20~50ｕL的雜交液到組織芯片TMA上，42℃~44℃濕盒中過夜。

２、在4×SSC中37℃洗滌15min

３、2×SSC，加入RNA酶（大致為10ｕg/ml）37℃中洗滌30min，

４、0.5×SSC,37℃洗滌15min

（八）關(guān)于原位雜交實驗技術(shù)封閉

１、1%正常山羊血清孵育30min

２、用抗體稀釋液稀釋堿磷酶標(biāo)記的抗地高辛抗體（1：500）37℃中孵育3h，PBS洗三次，每次5min

３、TSM1洗；

４、TSM2洗；

（九）顯色：用TSM2將NBT/BCIP按2：1稀釋進(jìn)行顯色；顯微鏡下掌握染色程度

（十）終止顯色：用水終止

（十一）  脫水，透明，封固

１、85%乙醇脫水，2min

２、95%乙醇脫水5min

３、無水乙醇脫水15min

４、二甲苯20min

５、封片，鏡檢

 

 

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